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Tecnologia NGS applicata alla sorveglianza fitosanitaria di virus e viroidi degli agrumi

"Le sempre più frequenti emergenze fitosanitarie che colpiscono le colture agrarie richiedono un potenziamento dell'attività di sorveglianza fitosanitaria territoriale, quale strumento primario di prevenzione e di contenimento dei patogeni. Ciò vale ancor di più per i patogeni sistemici, in specie se trasmissibili mediante vettori, poiché non esiste alcuno strumento di difesa". A dirlo è Antonino Catara, già Ordinario di Virologia vegetale e di Patologia vegetale presso l'Università di Catania.

Antonino Catara e Grazia Licciardello

"Gli agrumi sono particolarmente esposti a questo rischio - aggiunge Catara - se si considera che i virus interamente caratterizzati sono 22, i viroidi 7, i liberibacter 3, più alcuni fitoplasmi e batteri, nonché numerosi altri patogeni virus simili. Di alcuni, diffusi a livello globale, sono disponibili metodi di rilevamento consolidati, di altri, confinati in aree agrumicole specifiche, si ha poca dimestichezza diagnostica ed epidemiologica. Pertanto, il lavoro di sorveglianza territoriale, necessario per tutelare l'agrumicoltura, risulta complesso e non sempre facile".

In uno studio portato a termine nell'ambito del progetto SIRPA  finanziato dal PO FESR Sicilia, la società Agrobiotech (capofila) ha messo a punto una nuova procedura che utilizza il sequenziamento ad alta produttività (HTS o NGS) e l'analisi bioinformatica di piccoli RNA interferenti (siRNA) come metodo di pre-screening per accelerare la diagnosi di casi sospetti, riducendo il numero di saggi biologici e molecolari (clicca qui per approfondire).

Sopra: virus e viroidi rilevati in tre campioni di agrumi sequenziati mediante tecnologia NGS e analizzati mediante pipeline bioinformatica. I patogeni identificati sono quelli con valori superiori a 90% di copertura genomica.

"Il metodo consente di identificare simultaneamente i 22 virus e i 7 viroidi già sequenziati - spiega ancora Catara - nonché di rilevare la presenza di tracce di altri virus e viroidi non ancora sequenziati. Inoltre, attingendo ai dati disponibili in GenBank è possibile confrontare gli isolati presenti nel campione in esame con gli isolati già sequenziati in altri paesi. Funzionalità, questa, che offre elementi di valutazione importanti dal punto di vista epidemiologico, che non è possibile ottenere con i metodi convenzionali, se non in tempi lunghi".

"Nello studio specifico - dice dal canto suo Grazia Licciardello del CREA-OFA di Rende - la tecnologia HTS è stata applicata per il rilevamento di infezioni miste di alcuni virus e viroidi chiave o emergenti, che l'Organizzazione Euro Mediterranea per la Protezione delle Piante indica strategici per la difesa dell'agrumicoltura del Mediterraneo. I risultati dimostrano che, attraverso il sequenziamento HTS dei frammenti di RNA generati dalla pianta nel tentativo di bloccare le infezioni da virus e viroidi, l'HTS fornisce uno stato fitosanitario completo dei campioni in esame, anche nel caso di infezioni multiple".

Sopra: l'analisi NGS consente anche di rilevare simultanea mente le differenze genetiche degli isolati che concorrono alle infezioni virali, nel caso in specie il virus della tristezza. Il grafico mette in evidenza i differenti profili dei campioni in esame, fra i quali spicca quello a destra, nettamente diverso dagli altri, che tuttavia non sono identici.

"La tecnologia HTS identifica, inoltre, infezioni miste di ceppi del virus della Tristeza (CTV) - conclude la ricercatrice – Si tratta di informazioni molto importanti dal punto di vista della sorveglianza territoriale, in quanto identificano gli isolati geneticamente diversi da quelli locali. Tuttavia, non distingue i caratteri fenotipici delle varianti non EU, che dovranno al momento essere analizzati con metodi biologici".


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