Oltre 220 ricercatori di 25 Paesi si sono riuniti a Riverside in California (USA) per la 21ma Conferenza dei virologi degli agrumi (IOCV), tenutasi dal 10 al 12 marzo. I lavori e le visite tecniche sono state occasione per condividere conoscenze e tecnologie, ma anche per tracciare strategie future.
"Dal punto vista delle tecnologie - commenta Antonino Catara, già chairman IOCV, che insieme a Francesco Di Serio del CNR ha portato il contributo della ricerca italiana nel settore - si registra una profonda rivoluzione dovuta all'impiego delle tecnologie di sequenziamento ad alta processività, che consentono di rilevare in tempi molto brevi e con maggiore sensibilità virus, viroidi e batteri presenti nelle piante. La tecnica è ormai impiegata in diversi laboratori sia per individuare nuovi virus sia per accertare lo stato fitosanitario del materiale destinato alla propagazione certificata, ma anche per il controllo del materiale di introduzione. Si prevede a breve la possibilità di stabilire degli standard condivisi anche per il rilevamento di patogeni finora difficilmente evidenziabili".
Sopra, il Prof. Catara al National Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates di Riverside (California): una delle 20 banche di germoplasma istituite nel 1987 dall'USDA nell'ambito del National Plant Germplasm System allo scopo di collezionare, risanare e mantenere germoplasma di agrumi e datteri
Vediamo di seguito quanto è emerso dai lavori californiani:
Allarme per un virus emergente del limone
Grande preoccupazione desta l'avanzamento del virus delle nervature gialle degli agrumi (CYVCV), un membro del genere Mandarivirus, rilevato per la prima volta in Pakistan (1988) da ricercatori italiani e successivamente rinvenuto in Turchia (2002), India (2003), Cina (2009) e Iran (2017). Con una velocità di diffusione sorprendente, grazie alla sua trasmissibilità attraverso materiale di propagazione infetto e attrezzi da lavoro, nonché vettori alati (Aphis craccivora, A. spiraecola e Dialeurodes citri), il virus infetta in modo asintomatico la maggior parte delle cultivar di agrumi, ma causa gravi danni su limone con perdite di produzione elevatissime.
Sopra: il virus della decolorazione nervature (CVCV) causa anche malformazione del margine e bollosità della lamina fogliare, più marcate su limone e arancio amaro.
Danni sono stati segnalati anche su mandarino Satsuma. L'analisi NGS del genoma ha permesso di accertare la compresenza del virus della maculatura anulare degli agrumi (indian citrus ring spot virus), malattia diffusa in India. "Per contenere la diffusione, si raccomanda l'impiego di tecniche diagnostiche adeguate per un controllo del materiale di propagazione (in particolar modo per le introduzioni e le collezioni) e l'adozione delle misure di prevenzione comuni a tutti i virus e viroidi. Tali misure sono indispensabili sulle piante madri e nei vivai".
Nuovi virus di arancio e mandarino
Ricercatori del CNR di Bari e dell'Università di Napoli hanno accertato che l'agente della malattia nota come concavità gommose (concave gum) è un virus a RNA con peculiarità specifiche che danno origine al nuovo genere Coguvirus. La malattia, un tempo molto diffusa su piante di arancio e mandarino, affligge ancora alcuni vecchi impianti e alcune cultivar di arancio introdotte con materiale di propagazione infetto. Virus molto simili, associati a decolorazioni "a foglia di quercia" a carico delle foglie giovani sono stati identificati dallo stesso gruppo italiano e da ricercatori spagnoli (IVIA) e del Texas.
Un momento durante le visite tecniche
Essi sono associati alle malattie note come impietratura e cristacortis, malattie che hanno in comune il sintomo fogliare indicato. Sono in corso ulteriori approfondimenti.
Questi risultati, che a prima vista potrebbero fare pensare a un appesantimento della situazione fitosanitaria complessiva, assumono grande rilievo in quanto hanno reso disponibili nuovi strumenti di indagine per la certificazione del materiale di propagazione.
Altri virus, uno rinvenuto in Sudafrica e quattro in Cina, riferibili su base bioinformatica all'ordine Bunyavirales potrebbero non essere di grande rilevanza, ma poiché possono infettare anche piante erbacee richiedono ulteriori indagini anche di tipo epidemiologico. Al momento, solo uno (denominato CLFaV-1) è ben identificato sulla base di test biologici e RT-PCR
Certificazione del materiale di propagazione
I rappresentanti di tutti i paesi hanno ribadito l'importanza dei controlli fitosanitari per assicurare che l'industria agrumicola mantenga livelli di sostenibilità e redditività. La presenza di patogeni trasmissibili per innesto (virus, viroidi o batteri) nel materiale di propagazione può, infatti, compromettere la sopravvivenza delle piante e la produttività degli impianti, con ripercussioni anche nel lungo tempo.
California, Australia, Sudafrica hanno compiuto molti passi avanti nell'adozione delle tecnologie NGS nei programmi di certificazione fitosanitaria, se pur con criteri diversi, in affiancamento alle tecniche convenzionali biologiche e molecolari. La California le sta già adottando nel programma di selezione clonale degli agrumi (Citrus Clonal Protection Program, CCPP), nel California Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program e nel programma nazionale di germoplasma sano (National Clean Plant Network, NCPN), grazie all'intensa e proficua collaborazione fra industria, università, ed agenzie regolatorie. Un'attività affidata al coordinamento del Dipartimento di Patologia vegetale e del Dipartimento di Agricoltura. I due programmi hanno l'obiettivo di assicurare materiale di propagazione di tutte le specie controllato sotto il profilo genetico e fitosanitario. In tale ambito, è stato messo a punto un metodo di rilevamento dei viroidi molto più efficiente e veloce di quelli in uso, peraltro già sviluppato recentemente in Agrobiotech.
In Sudafrica, la tecnologia NGS è adottata nel programma di quarantena (Post Entry Quarantine, PEQ) che costituisce un passaggio importante del programma di miglioramento degli agrumi (Citrus Improvement Scheme, CIS) adottato dal Dipartimento di Agricoltura per impedire l'introduzione di patogeni esotici attraverso marze, semi e tessuti vegetali. In Australia è utilizzata per controllare i patogeni endemici ed esotici presenti nelle collezioni di germoplasma, che spesso costituiscono il cavallo di Troia per la diffusione di nuovi patogeni.
Lo stato dei lavori in Italia è stato presentato da Agrobiotech relativamente ad applicazioni complesse, quali l'analisi dell'intero viroma in campioni con infezioni di virus e viroidi endemici ed esotici, quali i pericolosi virus delle nervature gialle degli agrumi (CYVCV) e del nanismo del citrange (CSV) attualmente non regolamentati dalla direttiva UE. Interesse hanno anche suscitato i risultati sul genoma di alcuni isolati del gruppo VT di CTV con proprietà protettive rispetto alla popolazione locale del virus, finora accertate solo per isolati dei ceppi T68 (in Sud Africa) e T36 (in Florida).
Nonostante la mole di risultati, prevale l'idea che, in attesa di ulteriori dati e standard condivisi, l'adozione delle tecnologie NGS dovrà servire per accelerare lo screening del materiale di propagazione e potrà essere usata per accelerare il rilascio in campo del materiale di propagazione. Riducendo tempi, lavoro e costi, in attesa che i test biologici e molecolari siano portati a termine nei modi convenzionali.
Nuovi risultati sul virus della tristeza
In Sudafrica, lo studio di isolati di CTV T68 per la gestione della sindrome butteratura del legno su pompelmo (stem pitting) da CTV mediante la tecnica "cross-protection" ha permesso di accertare che differenti popolazioni di uno stesso ceppo concorrono alla composizione della sindrome e ne influenzano l'espressione.
In California sono stati messi a punto nuovi marker per distinguere isolati di CTV RB e un nuovo genotipo S1, con diversa aggressività e profilo biologico.
"Agrobiotech ha presentato un innovativo sistema di genotipizzazione degli isolati di CTV in un piccolo chip di meno di 2 cm2 - ha concluso Catara - che attraverso una selezione di 12 primer e 44 sonde esegue in sequenza sia il processo di amplificazione RT-PCR che l'ibridizzazione, permettendo di distinguere i diversi ceppi isolati, identificare la struttura genetica della popolazione del virus e rilevare le differenze genomiche fra i diversi isolati".